LONZA Amaxa 4D-Nucleofector細胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

在生命科學(xué)研究中，將DNA、RNA或蛋白質(zhì)引入細胞，以改變其基因型或表型的過程被稱為轉(zhuǎn)染，在各類研究中十分重要。傳統(tǒng)的電穿孔是一種物理轉(zhuǎn)染方法，通過對細胞施加電脈沖，改變細胞膜的通透性，并通過電場將外源分子移動到細胞中。電穿孔技術(shù)是細胞系中轉(zhuǎn)染大型DN段的強大工具，但其高細胞毒性、轉(zhuǎn)染原代細胞和干細胞的低效率，限制了其廣泛應(yīng)用。


LONZA 4D-Nucleofector（原Amaxa 4D-Nucleofector）細胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，創(chuàng)新性地結(jié)合經(jīng)典電穿孔技術(shù)和細胞特異性電轉(zhuǎn)染液，實現(xiàn)了DNA、RNA、小分子物質(zhì)高效轉(zhuǎn)染各類哺乳動物貼壁細胞和懸浮細胞。

LONZA 4D-Nucleofector技術(shù)不依賴于細胞有絲，不受細胞增殖的影響，可直接將外源基因?qū)爰毎酥?，即使是未的原代細胞（如靜止的T淋巴細胞或神經(jīng)元），也可以快速表達。


圖. GFP標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新生兒皮膚成纖維細胞，2小時后用3.5% PFA 固定，共聚焦顯微鏡可觀察到GFP蛋白在細胞核內(nèi)表達。

LONZA Nucleofector對質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率高達90％，寡核苷酸（如siRNA）轉(zhuǎn)染效率高達99％，面世20年來，已成功轉(zhuǎn)染＞1200種細胞系、＞130種原代細胞，并在干細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞等各類較難轉(zhuǎn)染的細胞中獲得了優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效果。

4D-Nucleofector細胞核轉(zhuǎn)染特點
1.針對每種細胞優(yōu)化的電脈沖參數(shù)，可將底物導(dǎo)入細胞質(zhì)甚至是細胞核；
2.特殊配方的電轉(zhuǎn)染液，同時提供高轉(zhuǎn)染效率和細胞保護，提高細胞轉(zhuǎn)染后存活率；
3.全程實驗指導(dǎo)，從細胞來源、傳代、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、到轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)技巧，已形成成熟的實驗方案。



4D-Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)為基因治療研究、免疫治療研究、干細胞研究等提供了方便的工具。相比電穿孔在內(nèi)的其他非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，更具優(yōu)勢：
-采用高分子聚合物電極，避免傳統(tǒng)鋁電極的離子毒害，維持細胞生理狀態(tài)，提高存活率。
-轉(zhuǎn)染后可快速觀察實驗結(jié)果，例如轉(zhuǎn)染GFP后zui快2小時可觀察到蛋白。
-無需自己優(yōu)化條件，擁有超過650種細胞類型的現(xiàn)成程序，可直接使用，quan球共享數(shù)據(jù)庫，超過1500條轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)可供參考。
-可轉(zhuǎn)染包括DNA、mRNA、miRNA、siRNA、肽、蛋白質(zhì)在內(nèi)的多種底物。
-可用于難以轉(zhuǎn)染的原代細胞、干細胞、神經(jīng)元、細胞系。
-可不用消化細胞，進行貼壁細胞的原位轉(zhuǎn)染。
-靈活的轉(zhuǎn)染規(guī)?？s放，可在低、中、高通量中輕松轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)2×10^4至1×10^9個細胞數(shù)量的輕松擴展。
-已在quan球8000多家同行評議的出版物中發(fā)表。

最近，LONZA 4D-Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于通過RNAi、CRISPR進行的基因編輯研究、以及iPS誘導(dǎo)多能干細胞、CAR-T的研究中，在包括功能和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)以及基因和細胞療法的研究中大放異彩。

LONZA 4D-Nucleofector細胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)參數(shù)

4D-Nucleofector細胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計，可根據(jù)研究者的需求，自行組合數(shù)個模塊形成一套完整系統(tǒng)。

常用模塊組合參考：
常規(guī)小規(guī)模轉(zhuǎn)染：C+X
貼壁細胞原位轉(zhuǎn)染：C+Y
懸浮+貼壁細胞轉(zhuǎn)染：C+X+Y
大規(guī)模轉(zhuǎn)染：C+X+LV
摸索復(fù)雜轉(zhuǎn)染條件：C+X+96孔



各模塊功能和應(yīng)用：
1、C模塊：4D-Nucleofector系統(tǒng)的控制單元，內(nèi)置轉(zhuǎn)染程序，將不同的功能單元（模塊）整合為一個系統(tǒng)，以運行不同的應(yīng)用程序。



2、X模塊：用于懸浮細胞、或貼壁細胞消化后的小規(guī)模轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量2×10^4至2×10^7?？赏瑫r轉(zhuǎn)染2個100μL電轉(zhuǎn)杯、1個16孔電轉(zhuǎn)板條（每孔20μL），每個電轉(zhuǎn)杯、每個孔可獨立設(shè)置程序。另外在使用96孔模塊時，也需要X模塊。



3、Y模塊：用于貼壁細胞不經(jīng)消化的原位轉(zhuǎn)染，可同時轉(zhuǎn)染1個24孔電轉(zhuǎn)板條（每孔350μL），每個孔可獨立設(shè)置程序。



4、LV模塊：用于同一種懸浮細胞、或同一種貼壁細胞消化后的大規(guī)模轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量1×10^7至1×10^9?？墒褂?mL手動進樣電轉(zhuǎn)盤、或20mL連續(xù)進樣電轉(zhuǎn)盤。通常使用X模塊小試摸條件，再用LV模塊線性放大轉(zhuǎn)染規(guī)模。



5、96孔模塊：用于同時轉(zhuǎn)染96個樣品的細胞，轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量2×10^4至1×10^6。每個孔可獨立設(shè)置程序。必須與X模塊結(jié)合使用。



參考文獻：
1.Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.Strecker J, et al. Nature (2019) 10(1): 212 

2.Gene correction for SCID-X1 in long-term hematopoietic stem cells.Pavel-Dinu M, et al. Nat Commun. (2019) 10 (1): 1634

3.Orthotopic replacement of T-cell receptor a- and ?-chains with preservation of near-physiological T-cell function.Schober K, et al. Nat Biomed Eng (2019) 10: 01 

4.Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.Oh SA, et al. Curr Protoc Immunol (2019) 124(1): e69 

5.Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nguyen DN, et al. Nat Biotechnol (2019) 1: 1 

6.CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Hultquist JF, et al. Nat Protocols (2019) 14(1): 1-27 

7.Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.Chen Cheng, et al. J Med Genetics (2019) 56: 10–17 

8.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Shifrut E, et al. Cell (2018) 175(7): 1985-1971 

9.Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells. Ting PY, et al. Nat Methods (2018) 15(11)

10.Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.Castiglia S,et al.J Transl Med (2018) 16: 237 

11.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Vakulskas CA,et al.Nat Med (2018) 24(8): 1216-1224

12.Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.Roth TL,et al.Nature (2018) 559: 405-9

13.Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.Hu B,et al.Hum Gene Ther (2018)

14.Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Seki A,et al.J Exp Med (2018) 215(3): 985-997

15.Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium.Medvec AR,et al.Mol Ther Methods Clin Dev. (2017) 7; 8: 65-74

16.Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.Hudecek M1,et al.Clin Exp Immunol (2017) 52(4): 355(80) 

17.CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors.Bak RO,et al.Cell Rep (2017) 20(3): 750-756 

18.CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells.Zhang Y,et al.Frontiers in Immunology (2017) 1: 1-9 

19.CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.Rupp LJ1,et al.Scientific Reports (2017) 7 (1): 737 

20.A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors.Park RJ, et al.Nat Genet (2017) 49(2): 193-203