NEB DNA連接酶

-重組T4 DNA連接酶、T4快速連接酶、T7 DNA連接酶

北京云肽生物科技代理的美國(guó)進(jìn)口NEB DNA連接酶，包括T4 DNA連接酶、T4 DNA快速連接酶試劑盒、T7 DNA連接酶、電轉(zhuǎn)連接酶等，覆蓋平末端連接酶、T/A連接酶、無(wú)縫克隆連接酶、快速連接酶等廣泛類型，為生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中分子克隆相關(guān)應(yīng)用提供豐富、高效的連接酶選擇。

NEBT4DNA 連接酶作為NEB優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品，連接效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，滿足傳統(tǒng)酶切克隆、Golden Gate組裝無(wú)縫克陸、TA克隆在內(nèi)的各類克隆需求，成為DNA連接酶的理想選擇。

①高性能--NEBT4 連接酶可實(shí)現(xiàn)10min連接粘性末端、2h連接平末端(或高濃度連接酶10min連接平末端)、5min快速連接粘性末端或平末端等，連接性能非常高效。

②種類豐富--NEB針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行配方優(yōu)化，提供耐鹽、耐熱、電轉(zhuǎn)連接酶等多種類型，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜實(shí)驗(yàn)需求。

③質(zhì)控嚴(yán)格--NEB DNA 連接酶具備非常高的酶純度、連接活性高、無(wú)其他酶干擾、質(zhì)控嚴(yán)格，產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告COA除提供連接酶活性、SDS-PAGE純度外，更對(duì)內(nèi)切酶、外切酶活性進(jìn)行驗(yàn)證，保證產(chǎn)品質(zhì)量高水準(zhǔn)。

1、NEB T4 DNA連接酶

NEBT4 DNA連接酶(T4 DNA Ligase，貨號(hào)M0202)，是重組連接酶，可連接平末端、粘性末端，還可修補(bǔ)雙鏈DNA和部分DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻位點(diǎn)，適用于高復(fù)雜性文庫(kù)克隆。室溫(20~25℃)條件下，連接粘性末端，在20pl反應(yīng)體系中加入1μL T4 DNA連接酶，反應(yīng)2h，或者加入1μL高濃度的T4 DNA連接酶反應(yīng)10min。可提供GMP級(jí)別產(chǎn)品。

2、NEB快速連接試劑盒

NEB快速連接試劑盒(Quick Ligation Kit，貨號(hào)M2200)，作為快速T4連接酶，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，在室溫條件下(25℃)，可在5min內(nèi)連接粘件末端或平末端DNA片段，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)并不會(huì)提高連接效率。

圖.時(shí)間連接進(jìn)程。LITMUS 28i載體經(jīng)EcoRV(平末端)或Hindlll(粘性末端)切割后，用小牛腸磷酸酶進(jìn)行處理和凝膠純化。使用NEB快速連接試劑盒將Haelll消化后的中X174DNA插入片段(平末端)和Hind!消化后的入 DNA播入片段(粘性末端)連按到各自的載體中，播入片段與載體的比例3:1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH-5a細(xì)胞中，并在37*C條件下LB-amp平板上過(guò)夜培養(yǎng)。

3、NEB平末端/TA連接酶預(yù)混液

NEB平末端/TA連接酶預(yù)混液(Blunt/TALigase MasterMix，貨號(hào)M0367)，即用型2x預(yù)混液，內(nèi)含T4 DNA 連接酶、連接增強(qiáng)劑和經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，專為提高平末端和單堿基突出末端的連接效率和轉(zhuǎn)化效率而設(shè)計(jì)。

圖.平末端/TA連接酶預(yù)混液提高了反應(yīng)通常較慢的末端連接的產(chǎn)量。在所有反應(yīng)條件下，使用高濃磨T4 DNA 連接酶、快速連接試劑盒、平末端/TA預(yù)混液的最終連接產(chǎn)物產(chǎn)量。切刻位點(diǎn)、粘性末端和3'單堿基突出末端的底物溫育15min進(jìn)行連接；5’單堿基突出末端的底物溫育1h進(jìn)行連接。

4、NEB瞬時(shí)粘性未端連接酶預(yù)混液

NEB瞬時(shí)粘性末端連按酶預(yù)混液(instant sticky-end Ligase Master Mix，貨號(hào)M0370)，即用型2x預(yù)混液，內(nèi)含T4DNA連核酶、連接增強(qiáng)劑，優(yōu)化了酶和緩沖液組分的比例，專為照時(shí)連接粘性未端(2~4bp)和提高轉(zhuǎn)化率設(shè)計(jì)。當(dāng)DNA量少且濃度較低時(shí)，仍可進(jìn)行亞克隆連接，節(jié)省寶貴的DNA樣本，并且無(wú)需稀釋，可直接轉(zhuǎn)化到多種化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌菌株中。

5、NEB電轉(zhuǎn)連接酶

NBE電轉(zhuǎn)連接酶(ElectroLigase，貨號(hào)M0369)，由T4DNA連接酶和經(jīng)優(yōu)化的即用型2x反應(yīng)緩沖液組成，內(nèi)含連接增強(qiáng)劑，不含PEG，專業(yè)用于促進(jìn)各種DNA末端(平末端、粘性末端、TA末端)的高效連接和電轉(zhuǎn)化，可在低DNA濃度的小體系中進(jìn)行亞克隆連接，節(jié)省寶貴的DNA樣品，無(wú)需純化或稀釋，反應(yīng)液可直接轉(zhuǎn)化到多種電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌菌株中，也可用于化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌菌株。

圖.使用電轉(zhuǎn)連接酶建立連接反應(yīng)體系，內(nèi)含等量的(20ng載體和3倍摩爾量的插入片段)平末端(A)、T/A(B)或粘性末端(C)載體/插入片段，并溫育如圖所示的相應(yīng)時(shí)間。熱失活后，每個(gè)反應(yīng)取2μL直核轉(zhuǎn)化到NEB 10-beta 電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌中。取50μL的復(fù)蘇菌液(某些情況下需要稀釋)涂到選擇性培養(yǎng)板上，37℃溫育過(guò)夜。最后統(tǒng)計(jì)菌落。

6、NEB Hi-T4 耐熱DNA連接酶

NEB Hi-T4耐熱DNA連接酶(Hi-T4 DNA Ligase，貨號(hào)M2622)，是經(jīng)基因工程改造的T4 DNA連接酶的變體，改善了熱穩(wěn)定性，可在高達(dá)50℃條件下連按平末端和粘性末端，還可修補(bǔ)雙鏈DNA、RNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。

圖.Hi-T4耐熱DNA連接酶的耐熱性優(yōu)于T4 DNA 連接酶。400單位T4 DNA 連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶在無(wú)DNA底物的1xT4 DNA 連接酶緩沖液中，以45℃預(yù)溫育指定時(shí)長(zhǎng)。加入0.12μM  Hindlll(粘性末端)熒光標(biāo)記片段，并以37℃溫育15min，測(cè)試連接酶的剩余活性。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。T4 DNA 連接酶在45°C時(shí)逐漸失去活性，而Hi-T4耐熱DNA連接酶即使在45°C溫育72h后在連接粘性末端底物上仍保持完整活性。

圖.Hi-T4耐熱DNA連接酶對(duì)更高溫度循環(huán)的耐受性優(yōu)于T4 DNA連接酶。在1 X T4DNA 連接酶緩沖液中，分別用1000單位T4 DNA連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶與DNA(1μg PBR322)進(jìn)行循環(huán)溫浴。循環(huán)溫度設(shè)置為:42℃(A)或50℃(B)5min，16℃5min。在指定的循環(huán)次數(shù)(0、15、30、45或60次)之后.以熒光標(biāo)記的粘性末端底物(Hindlll突出末端，25℃時(shí)10min)檢測(cè)連接酶活性。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。顯示了連接酶的利余活性(相對(duì)于0循環(huán)數(shù)劇點(diǎn))。

A:在16℃和42℃條件下，T4 DNA連接酶經(jīng)過(guò)循環(huán)后逐漸失去活性(金黃線)，而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經(jīng)過(guò)60次循環(huán)后仍保持活性(橙紅線)。

B:在16℃和50℃的15次循環(huán)后，T4 DNA連接酶wan全失去活性(金黃線)，而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經(jīng)過(guò)60次循環(huán)后仍保持約60%的活性(橙紅線)

7、NEB Salt-T4 耐鹽DNA連接酶

NEB Salt-T4耐鹽DNA連接酶(Salt T4 DNA Liase:貨號(hào)MO467)，是經(jīng)基因工程改造的T4 DNA連接酶的變體，具備更強(qiáng)的耐鹽性，反應(yīng)體系中高達(dá)300mM的鹽濃度不影響連接酶活性。該酶不僅能夠連接平末端和粘性末端，還可修補(bǔ)雙鏈DNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。

圖.與T4 DNA連接酶相比，Salt-T4耐鹽DNA連接酶對(duì)粘性末端底物表現(xiàn)出更高的耐鹽性。取400單位的T4 DNA連接酶或Salt-T4耐鹽DNA連接酶與0.12μM熒光標(biāo)記的Hindlll酶切片段(粘性末端)，在鹽量梯度(0~1000mM NaCL)的1 X T4 DNA連接酶緩沖液中25℃溫育10min。連接產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。當(dāng)鹽濃度超過(guò)200mM時(shí)，T4 DNA連接酶的活性迅速喪失;當(dāng)鹽濃度高達(dá)500mM時(shí)，Salt-T4耐鹽DNA連接酶連接粘性末端底物時(shí)仍保留>60%的活性。

8、NEB T3 DNA 連接酶

NEB T3 DNA連接酶(T3 DNA Ligase，貨號(hào)M0317)，來(lái)源于T3噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，對(duì)NaCL的耐鹽性是T4 DNA 連接酶的2倍，可用于粘性末端、平末端、切刻位點(diǎn)的連接，與T4 DNA 連接酶一樣，在反應(yīng)中加入PEG 6000 可以提高平末端連接效率。

9、NEB T7 DNA 連接酶

NEBT7 DNA連接酶(T7 DNA Ligase，貨號(hào)M0318)，來(lái)源于T7噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，僅可連接粘性末端，不能連接平末端，適用于當(dāng)DNA平末端和粘性末端同時(shí)存在，而僅需連接粘性末端時(shí)。

圖.T7 DNA 連接酶不會(huì)連接平末端DNA片段。每種底物取200ng，每種連接酶取1μl，建立包含平末端片段(ФX174 DNA-Haelll Digest)和粘性末端片段(λDNA-Hindlll Digest)的連接反應(yīng)體系，并在相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液中以25℃溫育30min。添加6×上樣染料立即終止反應(yīng)，然后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，再利用溴化乙錠進(jìn)行染色。

10、NEB Taq 高保真DNA連接酶

NEBTaq高保真DNA連接酶(HiFi Taq DNA Ligase，貨號(hào)M0647)，由熱穩(wěn)定DNA連接酶和添加劑組成，在高溫(37~75℃)范圍內(nèi)具有活性，多次熱循環(huán)后仍保持活性，能以非常高的保真度高效連接DNA切刻，適用于依賴連接酶的IVD技術(shù)(如連接酶鏈反應(yīng)LCR、連接酶檢測(cè)反應(yīng)LDR)，可降低錯(cuò)配連接。

11、NEBridge連接酶預(yù)混液

NEBridge連接酶預(yù)混液(NEBridge Ligase Master Mix，貨號(hào)M1100)，專用于Golden Gate無(wú)縫克隆，作為即用型3x預(yù)混液，含有T4 DNA 連接酶和連接增強(qiáng)劑，可與多種NEBIIS型限制性內(nèi)切酶搭配使用，進(jìn)行高效率、高保真的Golden Gate 組裝，支持在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行2~52個(gè)片段的組裝，可用于單片段克降和文庫(kù)構(gòu)建。

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